目的 基于高效液相色谱法(HPLC)同时检测小儿尿液中新蝶呤(N, CAS No:2009-64-5)和生物蝶呤(B, CAS:22150-76-1)的含量并探究KI-I氧化的条件。方法 采用KI-I2法氧化原型新蝶呤及生物蝶呤，在激发波长为350 nm，发射波长460 nm下使用HPLC进行检测，其中色谱柱选用Kromasil EternityXTC18(4.6*250mm，5μm)，流动相为甲醇:水(10:90)。结果 新蝶呤及生物蝶呤的线性均在0.9999以上，检测范围为新蝶呤：0.00625mg/mL~1.0mg/mL，生物蝶呤：0.00675 mg/mL~1.08 mg/mL，加标回收率在92.18%~98.24%。氧化过程中，普通实验室的光照对实验无明显的影响，氧化前不酸化尿液会造成测量的N、B值减小。结论 使用优化方法检测小儿尿液中的新蝶呤、生物蝶呤与尿肌酐的含量比值，并通过计算B %(百分比)，有助于高苯丙氨酸的鉴别分型，对患儿的治疗及预防发病具有重要意义。